Karakteristik teknik ak ladrès itilizasyon mikwoskòp fluoresans de foton
Mikwoskopi fluoresans de foton se yon nouvo teknoloji ki konbine mikwoskospi konfokal lazè ak teknoloji eksitasyon de foton.
Prensip debaz eksitasyon de foton se: nan ka gwo dansite foton, molekil fliyoresan ka absòbe de foton longèdonn long an menm tan, epi emèt yon foton longèdonn ki pi kout apre yon kout peryòd de sa yo rele lavi eksite eta. . ; Efè a se menm jan ak lè l sèvi avèk yon foton ki gen yon longèdonn mwatye longèdonn long la pou eksite yon molekil fliyoresan. Eksitasyon de foton mande pou yon gwo dansite foton. Yo nan lòd yo pa domaje selil yo, mikwoskospi de foton sèvi ak lazè enpulsyonèl mòd-fèmen ki gen gwo enèji. Lazè a emèt pa lazè sa a gen gwo enèji pik ak ba enèji mwayèn, lajè batman kè li se sèlman 100 femtoseconds, ak peryòd li yo ka rive nan 80 a 100 megahertz. Lè w ap itilize yon gwo lantiy objektif ouvèti nimerik pou konsantre foton lazè enpulsyonèl la, dansite foton nan pwen fokal lantiy objektif la se pi wo a, epi eksitasyon de foton sèlman rive nan pwen fokal lantiy objektif la, kidonk. mikwoskòp de-foton pa bezwen yon pinhole konfokal, ki amelyore efikasite deteksyon Fluorescence. Li se yon metòd rechèch enpòtan nan domèn mòfoloji, byoloji selil molekilè, nerosyans, ak famasi.
1. background nan nan Aparisyon nan mikwoskòp de-foton - de limit nan mikwoskòp tradisyonèl lazè konfokal:
1) Youn nan se fenomèn fototoksisite a: paske pinhole konfokal la dwe piti ase pou jwenn yon imaj-wo rezolisyon, ak ouvèti a ti pral bloke yon gwo pati nan fluoresans ki emèt nan echantiyon an, ki gen ladan fliyoresans ki emèt nan plan fokal la, korespondan an Wi, limyè eksitasyon an dwe fò ase pou jwenn yon rapò siyal-a-bri ase; ak lazè a wo entansite pral lakòz lank fliyoresan an fennen rapidman pandan optik kontinyèl, ak siyal la fliyoresan ap vin pi fèb ak pi fèb kòm optik la ap pwogrese.
2) fototoksisite se yon lòt pwoblèm. Anba iradyasyon lazè, anpil molekil lank fliyoresan yo pral pwodwi sitotoksin tankou oksijèn singlet oswa radikal gratis, kidonk tan optik la ak dansite pouvwa optik limyè eksitasyon an ta dwe limite nan eksperyans la pou kenbe dansite echantiyon an. aktif. Nan rechèch la sou echantiyon aktif, espesyalman plizyè etap nan kwasans ak devlopman nan echantiyon aktif, photobleaching ak fototoksisite fè etid sa yo trè limite.
2. Poukisa ou di ke mikwoskòp de-foton jeneralman pa bezwen ekipe ak lazè eksitasyon iltravyolèt?
Mikwoskopi de foton se yon teknoloji eksitasyon fluoresans ki baze sou efè eksitasyon de foton: molekil lank fliyoresan yo ka eksite lè yo absòbe de foton ki ba-enèji an menm tan (entèval tan ant de foton ki rive nan molekil fliyoresan se mwens pase 1 femtosecond. ), efè eksitasyon li yo ka ekivalan a absòbe yon foton gwo enèji nan 1/2 longèdonn. Pou egzanp, absòbe de foton nan longèdonn wouj ekivalan a yon molekil ki absòbe iltravyolèt. Foton longèdonn yo pa fasil absòbe selil yo, kidonk fototoksisite nan selil k ap viv yo redwi, epi tou redwi fototoksisite. Nan fason sa a, li pa sèlman jwe fonksyon eksitasyon iltravyolèt, men tou, evite domaj limyè iltravyolèt nan echantiyon an.
3. Ki sa ki espesyal sou lazè a nan mikwoskòp de-foton?
Pwobabilite pou absòpsyon de foton depann de ki jan de foton ensidan yo kowenside nan espas ak tan (de foton yo dwe rive nan 10-18 segonn). Seksyon transvèsal absòpsyon de foton an piti, epi sèlman fluorofò nan rejyon ki gen yon gwo flux foton yo eksite. Se poutèt sa, pi fò nan lazè yo itilize yo se lazè safi Titàn, ki ka reyalize pikosecond oswa femtosecond vitès optik, epi yo gen trè wo pik pouvwa ak ba pouvwa mwayèn, se konsa ke photobleaching ak fototoksisite ka redwi oswa elimine. Bagay ki pi enpòtan an se bay yon dansite trè wo nan foton nan yon seri ti, ki ka asire eksitasyon an similtane nan de foton.
4. Ki avantaj ki genyen nan eksitasyon de foton?
1) Ogmante selektivite nan lank la: ranje limyè eksitasyon nan lazè sistèm konfokal la (Ar, Ar/Kr, HeNe) se 488nm - 647nm. Sa vle di fè eksperyans ak UV-eksite koloran fliyoresan, tankou DAPI, Hoescht. Longèdonn eksitasyon de-foton se de fwa sa ki nan yon sèl-foton, kidonk koloran eksite pa iltravyolèt ka eksite pa limyè tou pre-enfrawouj.
2) Diminye photobleaching: Akòz rediksyon nan photobleaching, to siksè eksperyans lè l sèvi avèk CFP / YFP pou transfè enèji sonorite fluoresans (FRET) ogmante.
3) Pa gen okenn lantiy objektif espesyal ki nesesè: Soti nan pwen de vi pyès ki nan konpitè, eksitasyon an nan koloran UV-eksite ak longèdonn limyè tou pre-enfrawouj pa mande pou konpozan espesyal UV optik.
4) Amelyore rapò siyal-a-bri: longèdonn limyè eksitasyon an ak longèdonn limyè ki emèt la gen yon gwo diferans, ki amelyore rapò siyal-a-bri.
5) klowòks lokalize nan pwen fokal la: Depi eksitasyon fluoresans rive sèlman nan pwen fokal objektif la, pa gen okenn nesesite pou yon pinhole konfokal. Sa a amelyore deteksyon limyè ak photobleaching fèt sèlman nan pwen fokal la.
6) Pi fasil pou penetre espesimèn yo: Limyè longèdonn enfrawouj pa fasil gaye pa selil yo epi yo ka antre pi fon espesimèn yo.
5. Konpare ak mikwoskospi konfokal optik lazè, ki sa ki pi gwo amelyorasyon ki fèt pa mikwoskòp de foton?
1) Redwi photobleaching.
2) Redwi fototoksisite.
3) Li pa fasil pou gaye, epi li pi fasil pou antre nan echantiyon epè, tankou tranch nan sèvo.
