Prensip Mikwoskopi Fluoresans
Mikwoskòp fliyoresan yo diferan de mikwoskòp optik òdinè. Olye pou yo obsève espesimèn anba lumières nan sous limyè òdinè, yo sèvi ak limyè nan yon longèdonn sèten (anjeneral limyè iltravyolèt, limyè ble-vyolèt) eksite sibstans ki fliyoresan nan espesimèn yo anba mikwoskòp la fè yo emèt fliyoresans. Se poutèt sa, sous limyè a nan yon mikwoskòp fliyoresan pa fonksyone kòm limyè dirèk, men kòm yon sous enèji ki eksite sibstans ki fliyoresan nan echantiyon an. Rezon ki fè nou ka obsève echantiyon an se akòz ekleraj sous limyè a, men fenomèn fliyoresan prezante apre sibstans ki fliyoresan nan echantiyon an absòbe enèji limyè eksite.
Li ka wè ke karakteristik nan mikwoskòp fluoresans la se ke sous limyè li yo ka bay yon gwo kantite limyè eksitasyon nan yon seri longèdonn espesifik, se konsa ke sibstans ki fliyoresan nan echantiyon an teste ka jwenn limyè a eksitasyon nan entansite ki nesesè yo. An menm tan an, mikwoskòp fliyoresan an dwe gen sistèm filtre ki koresponn lan.
Mikwoskopi fliyoresan se yon zouti esansyèl nan istochimi imunofluoresan. Li konpoze de sous limyè ultra-wo vòltaj, sistèm filtre (ki gen ladan eksitasyon ak plak filtre suppression), sistèm optik ak sistèm fotografi ak lòt konpozan prensipal yo. Li itilize limyè nan yon longèdonn sèten pou eksite echantiyon an emèt fliyoresans.
Fason pou eksite fluoresans: Dapre ranje longèdonn limyè a, li ka divize an de kalite: metòd eksitasyon UV (lè l sèvi avèk metòd ekleraj iltravyolèt) ak metòd eksitasyon BV (lè l sèvi avèk limyè ble-vyolèt). Metòd eksitasyon UV itilize limyè tou pre-iltravyolèt ki pi kout pase 400nm pou eksitasyon. Pa gen okenn limyè eksitasyon vizib nan metòd sa a, kidonk fliyoresans obsève a prezante fliyoresans nannan nan lank la, epi li fasil pou distenge fliyoresans espesifik sou echantiyon an ak otofluoresans nan tisi background nan.
Metòd eksitasyon BV la baze sou 404nm ak 434nm pou eksitasyon soti nan iltravyolèt ak limyè ble. Metòd sa a sèvi ak limyè ble pou iradyasyon echantiyon an, kidonk filtè a koupe nan sistèm obsèvasyon fliyoresans lan dwe itilize yon filtè ki ka konplètman bloke limyè ble a epi konplètman pase fliyoresans vèt ak jòn ki nesesè yo. Koloran fliyoresan pou tès antikò fliyoresan. Longèdonn maksimòm absòpsyon limyè eksitasyon an se relativman pre longèdonn emisyon maksimòm fliyoresan, kidonk filtè ki itilize nan metòd eksitasyon BV la dwe itilize yon filtè koupe byen file. Metòd sa a ka itilize limyè ble kòm limyè eksitasyon an, kidonk efikasite absòpsyon pigman fliyoresan an pi wo, epi yo ka jwenn yon imaj pi klere. Dezavantaj li se ke fluoresans ki anba a 500nm pa ka wè, ak fluoresans ki pi wo a 500nm fè imaj la antye parèt jòn. Nan metòd la antikò fliyoresan, espesifik nan fluorochrome a souvan jije pa koulè a inik nan fluorochrome la. Se poutèt sa, lè w ap diskite sou espesifik sibtil, enpèfeksyon yo mansyone anwo a nan metòd la eksitasyon BV souvan gen yon gwo enfliyans.
Pou rezime, ekleraj la nan mikwoskòp fluoresans la ka konsidere dapre twa pwen sa yo dapre estrikti a nan kondansasyon an ak longèdonn nan limyè a eksitasyon.
① Soti nan pèspektiv nan kondisyon yo kontras nan imaj la fliyoresan, yo itilize konsantratè nan jaden nwa eksitasyon UV pou ekleraj.
② Lè nou konsidere klète imaj la, filtre eksitasyon BV gen pi wo efikasite obsèvasyon jaden nwa.
③ Karakteristik yo nan UV eksitasyon filtre obsèvasyon jaden nwa ak eksitasyon BV limyè konsantratè jaden nwa ka konsidere kòm ant de metòd lumières sa yo, men ansyen an gen pi fò pwopriyete jaden nwa ak montre imaj pi klere. Kontras la piti; lèt la kenbe pwopriyete yo nan chemen an limyè jaden nwa, se konsa imaj la parèt pi fonse, ak kontras la amelyore. Lè w aktyèlman ap itilize yon mikwoskòp fluoresans, yo ta dwe itilize metòd lumières ki pi byen adapte egzijans echantiyon an pou obsèvasyon.
Li dwe fè remake ke menm si UV-eksite kondansasyon nan jaden nwa ak pi bon kontras la eklere, yon pati nan limyè a eksitasyon iltravyolèt refrakte oswa gaye pa echantiyon an pral antre nan lantiy la objektif. Autofluorescence ka vin pi mal repons imaj la. Se poutèt sa, yon filtre UV-absòbe dwe itilize devan oculaire a kòm yon filtre koupe.
