Metòd obsèvasyon prensipal la nan mikwoskòp optik se obsèvasyon fluoresans
Fluoresans refere a pwosesis kote yon sibstans fliyoresan emèt limyè ki gen yon longèdonn ki pi long prèske an menm tan lè li iradyasyon ak limyè ki gen yon longèdonn espesifik (Figi 1). Lè limyè nan yon longèdonn espesifik (longèdonn eksitasyon) frape yon molekil, tankou sa ki nan yon fliyofò, enèji foton yo absòbe pa elektwon molekil la. Apre sa, elektwon yo tranzisyon soti nan eta tè a (S0) nan yon nivo enèji ki pi wo, eta a eksite (S1'). Pwosesis sa a rele eksitasyon①. Elektwon an rete nan eta eksite pou 10-9–{10-8 segonn, pandan sa elèktron an pèdi kèk enèji②. Pandan pwosesis elektwon yo kite eta eksitasyon an (S1) epi retounen nan eta tè a③, enèji ki rete a absòbe pandan pwosesis eksitasyon an libere.
Tan rezidans molekil fliyoresan an nan eta a eksite se tout lavi fliyoresan, ki se jeneralman sou nivo nanosecond, epi li se yon karakteristik nannan nan molekil fliyoresan tèt li. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), ki sèvi ak teknoloji fluoresans pou tout lavi D, yo rele Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Anplis de imaj entansite fliyoresan, yo ka jwenn mezi fonksyonèl ak egzat plis pwofondè pou jwenn konfòmasyon molekilè, entèraksyon entè-molekilè, ak mikro-anviwònman molekil. Enfòmasyon ki difisil pou jwenn ak imaj optik konvansyonèl yo.
Yon lòt pwopriyete enpòtan nan fluoresans se chanjman nan Stokes, diferans ki genyen nan longèdonn ant eksitasyon ak pik emisyon (Figi 2). Tipikman longèdonn emisyon an pi long pase longèdonn eksitasyon an. Sa a se paske elektwon yo pral pèdi yon pati nan enèji yo atravè pwosesis detant la apre sibstans fliyoresan an eksite epi anvan yo lage foton. Sibstans fliyoresan ak pi gwo chanjman Stokes yo pi fasil pou obsève anba yon mikwoskòp fliyoresan.
Mikwoskopi Fluoresan ak Kib Filter Fluoresans
Mikwoskòp fliyoresan se yon mikwoskòp optik ki itilize pwopriyete fliyoresan pou obsèvasyon ak imaj, epi li lajman ki itilize nan divès domèn tankou byoloji selilè, nerobyoloji, botanik, mikrobyoloji, patoloji, ak jenetik. D Fluorescence gen avantaj ki genyen nan sansiblite segondè ak espesifik, epi li trè apwopriye pou obsèvasyon distribisyon an nan pwoteyin espesifik ak òganèl nan tisi ak selil, etid la nan kolokizasyon ak entèraksyon, swiv nan pwosesis dinamik lavi tankou chanjman konsantrasyon ion. , elatriye.
Pifò molekil nan selil yo pa fliyoresan, epi pou yo wè yo dwe gen etikèt fluorescent. Gen anpil metòd pou etikèt fliyoresan, tankou etikèt dirèk (tankou lè l sèvi avèk DAPI pou mete etikèt sou ADN), oswa imunostaining lè l sèvi avèk pwopriyete yo antijèn-obligatwa nan antikò, oswa lè l sèvi avèk pwoteyin fliyoresan (tankou GFP, vèt fliyoresan pwoteyin) pou mete etikèt sou pwoteyin sib yo. , ak revèsib obligatwa. Koloran sentetik (tankou Fura-2) ak sou sa.
Kounye a, mikwoskòp fliyoresan an te vin ekipman estanda D 'nan divès laboratwa ak platfòm D, epi li se yon bon èd pou eksperyans chak jou nou an. Mikwoskòp fliyoresan yo sitou divize an twa kategori: mikwoskòp fliyoresan dwat (apwopriye pou tranche), mikwoskòp fliyoresan Envèse (apwopriye pou selil k ap viv, pran an kont tranche), stereoskòp fliyoresan (apwopriye pou pi gwo espesimèn, tankou plant, pwason zèb (granmoun/anbriyon). ), medaka, ògàn sourit/rat, elatriye).
Blòk filtre fliyoresan se eleman debaz nan D fluoresans mikwoskòp. Li konsiste de twa pati: filtre eksitasyon, filtre emisyon ak splitter gwo bout bwa dichroic. Li enstale nan wou filtre a. Pou egzanp, Leica DMi8 ekipe ak yon 6-wou filtre pozisyon (figi 3). Nimewo a nan pozisyon nan wou mikwoskòp diferan yo pral diferan, ak kèk mikwoskòp itilize glisad blòk filtre.
Blòk filtre a jwe yon wòl enpòtan nan imaj fluoresans: filtè eksitasyon an chwazi limyè eksitasyon an pou eksite echantiyon an, epi bloke limyè lòt longèdonn; limyè a pase nan filtè eksitasyon an pase nan glas dichroic la (fonksyon li se reflete limyè eksitasyon an ak transmèt fliyoresans la), apre refleksyon, li konsantre pa lantiy objektif la, irradiate echantiyon an, ak eksite fliyoresans ki koresponn lan, se sa ki. , limyè emèt. Limyè ki emèt la kolekte pa lantiy objektif la, pase nan splitter dichroic gwo bout bwa a, epi li rive nan filtè emisyon an. Jan yo montre nan Figi 4: longèdonn eksitasyon an se 450-490 nm, glas dichroic reflete limyè ki pi kout pase 510nm, transmèt limyè ki pi long pase 510nm, ak seri a resevwa nan limyè emèt se 520-560 nm.
