Mikwoskopik Imaging Salklas丨Aplikasyon nan mikwoskopi fluoresans
Mikwoskopi fluoresans refleksyon entèn total (TIRFM) se yon teknik ki itilize vag evanesan ki te pwodwi pa yon reyon limyè pwopaje ant de diferan medya endèks refractive pou sonde sifas selil vivan ki gen etikèt fluorescent. Nan pratik, lè yon reyon lazè ensidan rankontre koòdone ki genyen ant kouvèti a ak medyòm akeuz ki gen selil yo, li reflete nan ang kritik (total refleksyon entèn). Paske enèji vag evanesan an diminye eksponansyèlman ak distans ki soti nan kouvèti a, sèlman fliyofò ki nan 10 nanomèt sifas la (ant 10 ak 200 nanomèt) yo eksite pa vag evanesan an, pandan y ap fliyofò ki pi lwen yo lajman san eksite. Afekte. Kidonk, TIRFM rezilta nan nivo siyal segondè soti nan fluorophores ki sitiye tou pre kouvèti a, sipèpoze sou yon background trè nwa, bay yon ekselan rapò siyal-a-bri. Limit ekstrèm nan pwofondè eksitasyon se ideyal pou etidye molekil sèl oswa manbràn ak konpozisyon òganèl nan selil aderan tou pre sifas la kouvri (gade Figi 8 (e)). Depi eksitasyon an limite nan rejyon mens tou pre kouvèti a, photobleaching ak fototoksisite yo tou restriksyon nan rejyon sa yo, fè TIRFM youn nan metòd ki pi itil pou obsèvasyon alontèm. Teknik la vin tounen yon zouti fondamantal pou etidye yon pakèt fenomèn nan byoloji selilè ak molekilè.
Dekonvolusyon se yon algorithm aplike nan yon seri imaj tout konsantre akeri sou aks optik (Z) pou amelyore siyal foton nan yon pil imaj pou yon plan imaj bay oswa plizyè plan fokal. Mikwoskòp yo dwe ekipe ak gwo presizyon motè konsantre kondui pou garanti akizisyon imaj nan entèval ki byen defini ant plan fokal echantiyon an. Nan yon aplikasyon tipik (gade Fig. 8(f)), yo itilize pwosesis dekonvolusyon an pou debloke epi retire limyè ki pa konsantre nan yon plan fokal bay lè l sèvi avèk eksitasyon fliyoresans widefield ak emisyon. Aplikasyon ki pi konplèks la se aplike pwosesis dekonvolusyon an nan tout pil imaj la pou jenere opinyon projetée oswa modèl 3D. Yon seri imaj widefield yo itilize pou dekonvolusyon kaptire kantite maksimòm teyorik foton ki emèt pa echantiyon an. Pwosesis dekonvolusyon an redistribiye entansite "flouye" foton ki emèt anwo ak anba plan fokal la tounen nan plan orijinal la. Kidonk, dekonvolusyon itilize prèske tout entansite emisyon ki disponib epi li bay yon bidjè limyè optimal, ki fè teknik sa a metòd chwa pou echantiyon trè sansib pou limyè.
Yon varyant nan fenomèn nan transfè enèji sonorite sou mikwoskospi fliyoresan, fluoresans oswa Förster resonans enèji transfè (FRET) yo itilize pou jwenn enfòmasyon quantitative tanporèl ak espasyal sou obligatwa ak entèraksyon nan pwoteyin, lipid, anzim ak asid nikleyik nan selil k ap viv. FRET ka anplwaye swa konstan-eta oswa tan-rezoud teknik, men tan-rezoud D FRET gen avantaj nan kat plis presizyon distans donatè-akseptè. Yo ka itilize yon mikwoskòp fliyoresans estanda ki ekipe ak filtè eksitasyon ak emisyon apwopriye ak yon kamera sansib pou D FRET. Biosensors ki sandwich yon pwoteyin anviwònman an sansib oswa peptide ant de pwoteyin fliyoresan FRET-aplikab yo kounye a se lajman ki itilize nan byoloji selil. Sond sa yo fasilman imajine anba mikwoskopi fliyoresans lajè lè l sèvi avèk teknik FRET emisyon sansibilize konbine avèk analiz rasyonometrik. Anplis de sa, D spectral ak lineyè unmixing lè l sèvi avèk lazè optik mikroskopi konfokal ka ede kontwole fenomèn FRET nan byodetèktè ak lòt aplikasyon pou pwoteyin fliyoresan.
Mikwoskopi imaj fluoresans pou tout lavi (FLIM) se yon teknik sofistike ki kapab anrejistre ansanm lavi fluoresans ak kote espasyal yon fliyofò nan chak kote nan imaj la. Metòd sa a bay yon mekanis pou etidye paramèt anviwònman yo tankou pH, konsantrasyon iyonik, polarite sòlvan, entèraksyon ki pa kovalan, viskozite, ak tansyon oksijèn nan selil k ap viv sèl epi prezante done yo nan etalaj espasyal ak tanporèl. Mezi FLIM nan lavi eta eksite sou echèl nanosgond yo endepandan de konsantrasyon fliyofò lokal yo, efè photobleaching, ak longè chemen (epesè echantiyon), men yo sansib a reyaksyon eta eksite tankou transfè enèji sonorite. An reyalite, konbine FLIM ak FRET lè w kontwole chanjman donatè fliyoresan yo anvan ak apre transfè enèji sonorite yo konsidere kòm youn nan pi bon fason pou etidye fenomèn sa a.
Ka mobilite (koyefisyan difizyon transverse) nan makromolekil ki gen etikèt fluorescent ak ti fluorofò yo ka detèmine pa rekiperasyon fluoresans apre teknik photobleaching (FRAP). Nan FRAP, yon ti zòn chwazi (kèk mikromèt an dyamèt) se entans eklere, anjeneral ak yon lazè, yo pwodwi fotoblanchi konplè nan fluorophore nan zòn sa a. Rezilta a se yon rediksyon dramatik oswa aniilasyon fliyoresans. Apre yon batman fotoblanchi, yo te kontwole pousantaj ak limit rekiperasyon entansite fliyoresan nan rejyon blanchi kòm yon fonksyon tan nan entansite eksitasyon ki ba pou jenere enfòmasyon sou sinetik repoblasyon fluorophore ak rekiperasyon (Figi 9). FRAP anjeneral fèt lè l sèvi avèk EGFP oswa lòt pwoteyin fliyoresan. Teknik fotoaktivasyon ki gen rapò yo baze sou fliyofò espesyal sentetik kalòj oswa pwoteyin fliyoresan fonksyonèl menm jan an ki ka aktive pa kout batman UV oswa vyolèt. Photoactivation ak FRAP ka itilize kòm teknik konplemantè pou detèmine paramèt mobilite.
Nan yon teknik ki gen rapò ak FRAP, ki rele pèt fliyoresan apre fotoblanchiman (FLIP), yon rejyon fliyoresan defini nan yon selil vivan sibi fotoblanchi repete pa iradyasyon entans. Si tout fluorofò yo te kapab difize nan zòn nan fotoblanchi pandan peryòd tan mezire a, sa ta lakòz yon pèt konplè nan siyal fliyoresan nan tout selil la. Lè w kalkile pousantaj fliyoresans la disparèt nan tout selil la, yo ka detèmine mobilite difizyon fluorophore sib la. Anplis de sa, FLIP ka fasilman idantifye kote ak nati nenpòt baryè difizyon ant konpatiman endividyèl selil yo, tankou baryè ki genyen ant soma a ak axon nan yon newòn.
Fluoresans korelasyon spèktroskopi (FCS), sitou itilize nan lazè optik mikwoskòp konfokal oswa mikwoskòp multiphoton, se yon metòd ki fèt pou detèmine enfòmasyon sinetik tankou to reyaksyon chimik, koyefisyan difizyon, Teknik pou pwa molekilè, pousantaj koule ak agrégation. Nan FCS, yon ti volim (apeprè yon femtomèt; konsantre nan diffraction limite nan lazè a) eklere ak yon reyon lazè konsantre pou anrejistre fluctuations entansite otofluoresan pwovoke pa dinamik molekil fliyoresan kòm yon fonksyon tan nan volim ki okipe pa fliyoresan. molekil (figi 10). Fluorofò relativman ti difize rapidman nan volim eklere a, ki pwodui kout entansite o aza. Okontrè, pi gwo konplèks (fluorophores mare ak makromolekil) deplase pi dousman, pwodwi pi long, ki pi pèsistan tan-depandan modèl entansite fluoresans.
Lè estrikti ki gen etikèt fluorescent yo chaje anpil epi sipèpoze nan rejyon espesifik selil k ap viv yo, dinamik yo ak distribisyon espasyal yo difisil pou analize. Mikwoskopi tach fliyoresan (FSM) se yon teknik konpatib ak prèske tout modalités D ki pran avantaj de konsantrasyon ki ba anpil nan subinite ki gen etikèt fluorescent, diminye fliyoresans ki pa konsantre, epi amelyore vizibilite estrikti ki make ak dinamik yo nan rejyon epè. FSM yo aplike lè yo mete etikèt sou sèlman yon fraksyon nan tout estrikti enterè a. Nan sans sa a, FSM sanble ak fè FCS sou tout jaden an de vi, byenke li mete plis anfaz sou modèl espasyal olye ke analiz tanporèl quantitative. Mikwoskopi tach fliyoresan se patikilyèman itil nan detèmine mobilite ak agrégation nan eleman cytoskeletal tankou aktin ak mikrotubul nan selil ipèaktif.
Stimulated emission depletion microscopy (STED) se yon teknik super-rezolisyon émergentes ak rezolisyon espasyal ki pi lwen pase limit difraksyon an, lè l sèvi avèk limyè ki gen fòm bag apovri pou antoure yon reyon limyè eksitasyon ki pi piti pou jwenn sub-50 nm sou-aks pou rezolisyon an. Teknik la depann sou eksitasyon fliyofò ak pulsasyon lazè senkronize ak pulsasyon STED sikilè kowòdone espasyalman ki diminye limyè ki emèt la, siprime fliyoresans molekil eksite alantou konsantre optik lazè a. Fliyoresans ki te pwodwi nan periferik tach la siprime, men se pa nan sant la nan plas la, kidonk siyifikativman diminye gwosè a nan plas la fliyoresan ak korespondan siyifikativman ogmante rezolisyon an. STED te pwouve yo dwe yon zouti itil pou deteksyon wo rezolisyon nan selil vivan yo. Lòt teknik super-rezolisyon émergentes, tankou mikwoskospi lokalizasyon fotoaktive (PALM) ak mikwoskospi limyè eklere estriktire (SIM), ap vin tou zouti fondamantal pou imaj selil vivan nan fiti prè.
Itilizasyon ogmante nan pwoteyin fliyoresan jenetikman kode ak fliyofò sentetik avanse pou imaj selil vivan ouvè pòt la nan nouvo modalité optik pou kontwole dinamik tanporèl ak relasyon espasyal. Mikwoskopis kounye a gen yon seri zouti konplè pou obsève ak anrejistre done imaj nan pwosesis selilè ki fèt sou yon pakèt echèl tan ak nan plizyè rezolisyon. Evènman pi dousman yo ka fasil obsève ak anrejistre lè l sèvi avèk mikwoskospi konfokal optik lazè, pandan y ap ka jwenn evènman pi rapid sinetik lè l sèvi avèk teknoloji ki gen kapasite k ap vire. Anplis de sa, mikwoskòp multiphoton pèmèt D 'fon anpil nan tisi epè, ak total teknik refleksyon entèn pèmèt sonde nan sifas manbràn ak presizyon konfokal. Metòd fliyoresan avanse, tankou FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM, ak STED, ka itilize pou kontwole entèraksyon pwoteyin-pwoteyin nan rezolisyon souvan pi bon pase sa yo pèmèt pa limit la diffraction. Ak pwogrè nan fluorophore, mikwoskòp ak teknoloji detektè, yon mond pi laj pral pote "anba mikwoskòp la".
