Mikwoskopi fliyoresan diferan de mikwoskopi konvansyonèl yo
Mikwoskòp fliyoresan sèvi ak limyè iltravyolèt kòm yon sous limyè pou iradyasyon objè a yo dwe enspekte, se konsa ke objè a emèt limyè, ak Lè sa a, obsève objè a anba mikwoskòp la. Li se sitou itilize pou selil imunofluoresan. Li se sitou ki konpoze de yon sous limyè, yon sistèm plak filtre ak yon sistèm optik yo obsève imaj la fliyoresan nan echantiyon an atravè agrandisman an nan oculaire a ak lantiy objektif. Ann pran yon gade nan diferans ki genyen ant mikwoskòp fliyoresan sa a ak yon mikwoskòp optik òdinè.
1. Gade metòd ekleraj la
Metòd ekleraj la nan mikwoskòp fliyoresan an jeneralman episkopik, sa vle di, sous limyè a projetée sou echantiyon tès la atravè lantiy objektif la.
2. Gade rezolisyon an
Mikwoskòp fliyoresan itilize limyè iltravyolèt kòm yon sous limyè, ak longèdonn lan relativman kout, men rezolisyon an pi wo pase sa yo ki nan mikwoskòp optik òdinè.
3. Diferans lan nan filtè a
Mikwoskòp fliyoresan yo sèvi ak de filtè espesyal, ki itilize devan sous limyè a pou filtre limyè vizib, epi yo itilize ant lantiy objektif la ak oculaire pou filtre reyon iltravyolèt, ki ka pwoteje je moun.
Mikwoskòp fliyoresan se tou yon kalite mikwoskòp optik, sitou paske longèdonn eksite pa mikwoskòp fliyoresan an kout, kidonk sa a mennen nan diferans lan nan estrikti ak itilizasyon ant mikwoskòp fluoresans la ak mikwoskòp òdinè. Pifò nan mikwoskòp fliyoresan yo gen yon bon fonksyon nan kaptire limyè fèb, kidonk anba fliyoresan trè fèb, kapasite D li yo se tou bon. Makonnen ak amelyorasyon kontinyèl nan mikwoskòp fliyoresan nan dènye ane yo, bri a te tou redwi anpil. Se poutèt sa, pi plis ak plis mikwoskòp fliyoresan yo itilize.
pè
Konesans sou Photon Fluorescence Microscopy
Prensip debaz eksitasyon de foton se: nan ka gwo dansite foton, molekil fliyoresan ka absòbe de foton longèdonn long an menm tan, epi emèt yon foton longèdonn ki pi kout apre yon kout sa yo rele lavi eta eksite; efè a se menm jan ak lè l sèvi avèk yon foton ak yon mwatye longèdonn nan longèdonn long la eksite molekil fliyoresan. De-foton eksitasyon mande pou yon gwo dansite foton. Yo nan lòd yo pa domaje selil yo, mikwoskospi de foton sèvi ak lazè enpulsyonèl mòd-fèmen ki gen gwo enèji. Lazè a emèt pa lazè sa a gen gwo enèji pik ak ba enèji mwayèn, lajè batman kè li se sèlman 100 femtoseconds, ak frekans li yo ka rive nan 80 a 100 megahertz. Lè w ap itilize yon gwo lantiy objektif ouvèti nimerik pou konsantre foton lazè enpulsyonèl la, dansite foton nan pwen fokal lantiy objektif la se pi wo a, epi eksitasyon de foton sèlman rive nan pwen fokal lantiy objektif la, kidonk la de-foton mikwoskòp pa mande pou yon pinhole konfokal, ki amelyore efikasite deteksyon fluoresans la.
An jeneral fenomèn fliyoresan, akòz dansite foton ki ba nan limyè eksitasyon an, yon molekil fliyoresan ka sèlman absòbe yon foton an menm tan, ak Lè sa a, emèt yon foton fliyoresan atravè yon tranzisyon radyativ, ki se yon sèl-foton fluoresans. Pou pwosesis eksitasyon fluoresans la lè l sèvi avèk lazè kòm sous limyè, fluoresans de-foton oswa menm milti-foton ka rive. Nan moman sa a, entansite sous limyè eksitasyon yo itilize a wo, ak dansite foton satisfè kondisyon molekil fliyoresan ki absòbe de foton an menm tan. Nan pwosesis pou yo itilize yon lazè jeneral kòm sous limyè eksitasyon, dansite foton a toujou pa ase pou pwodui fenomèn absòpsyon de foton. Anjeneral, yo itilize yon lazè enpulsyonèl femtosecond, ak pouvwa enstantane li ka rive nan lòd la nan megawatt. Se poutèt sa, longèdonn fluoresans de foton pi kout pase longèdonn eksitasyon limyè, ki ekivalan a efè eksitasyon ki pwodui nan mwatye longèdonn eksitasyon an.
Mikwoskopi fluoresans de foton gen anpil avantaj:
1) Limyè longèdonn long mwens afekte pa gaye pase limyè longèdonn kout epi li fasil antre echantiyon an;
2) Molekil fliyoresan deyò plan fokal la pa eksite, pou plis limyè eksitasyon ka rive nan plan fokal la, pou limyè eksitasyon an ka antre pi fon espesimèn;
3) Limyè longèdonn tou pre-enfrawouj se mwens toksik nan selil pase limyè longèdonn kout;
4) Lè w ap itilize yon mikwoskòp de foton pou obsève espesimèn, photobleaching ak fototoksisite fèt sèlman nan plan fokal la. Se poutèt sa, mikwoskospi de-foton pi apwopriye pase mikwoskospi sèl-foton pou obsève espesimèn epè, pou obsève selil k ap viv, oswa pou eksperyans photobleaching tach.
Konesans sou mikwoskopi fluoresans konfokal
Prensip debaz nan mikwoskospi fliyoresan konfokal: se echantiyon an iradyasyon pa yon sous limyè pwen, ak yon ti, ki byen defini tach limyè ki fòme sou plan an fokal. Apre pwen an iradyasyon, fliyoresans ki emèt la kolekte pa lantiy objektif la epi voye tounen nan splitter gwo bout bwa ki konpoze de yon glas dichroic sou chemen ekleraj orijinal la. Splitter gwo bout bwa a voye fliyoresans lan dirèkteman nan detektè a. Gen yon pinhole devan sous limyè a ak detektè a, respektivman rele pinhole ekleraj la ak pinhole deteksyon an. Gwosè jeyometrik de yo se menm, apeprè 100-200nm; parapò ak tach la limyè sou avyon an fokal, de yo se konjige, se sa ki, tach la limyè pase nan yon seri de lantiy, epi finalman ka konsantre sou pinhole a ekleraj ak pinhole deteksyon an menm tan an. Nan fason sa a, limyè ki soti nan avyon an fokal ka konvèje nan sijè ki abòde lan twou deteksyon an, pandan y ap limyè a gaye soti nan pi wo a oswa anba avyon an fokal bloke deyò twou a deteksyon epi yo pa ka imajine. Lazè a analize echantiyon an pwen pa pwen, ak tib la fotomultiplikatè apre detekte pinhole a tou jwenn imaj la konfokal nan pwen an korespondan limyè pwen pa pwen, ki se konvèti nan yon siyal dijital epi transmèt nan òdinatè a, epi finalman total nan yon klè. imaj konfokal tout plan fokal la sou ekran an.
Chak imaj avyon fokal se aktyèlman yon koup transvèsal optik nan echantiyon an, ak koup transvèsal optik sa a toujou gen yon epesè sèten, ke yo rele tou yon seksyon optik mens. Depi entansite limyè a nan pwen fokal la pi gran pase sa ki nan pwen ki pa konsantre, ak limyè avyon an ki pa fokal filtre soti nan pinhole a, pwofondè nan jaden nan sistèm konfokal la se apeprè zewo, ak optik ansanm la. Z-aks ka reyalize tomografi optik, fòme yon tranch optik ki genyen de dimansyon nan plas la konsantre nan echantiyon an yo dwe obsève. Konbine optik XY avyon (avyon fokal) ak optik Z-aks (aks optik), imaj ki genyen twa dimansyon echantiyon an ka jwenn nan akimile imaj ki genyen de dimansyon nan kouch kontinyèl ak trete pa lojisyèl òdinatè espesyal.
Sa vle di, pinhole deteksyon an ak pinhole sous limyè yo toujou konsantre sou menm pwen an, se konsa ke fluoresans eksite deyò avyon an fokal pa ka antre nan pinhole deteksyon an.
Ekspresyon ki senp nan prensip k ap travay nan konfokal lazè se ke li sèvi ak limyè lazè kòm sous limyè a. Sou baz tradisyonèl D' mikwoskòp fluoresans, li ajoute yon aparèy eskanè lazè ak yon aparèy konsantre konjige, epi li se yon sistèm pou akizisyon imaj dijital ak pwosesis atravè kontwòl òdinatè.
